Nhờ thành thạo tiếng Hy Lạp và La-tinh, Erasmus có thể so sánh các bản dịch Kinh Thánh tiếng La-tinh, như bản Vulgate tiếng La-tinh, với các bản chép tay tiếng Hy Lạp thời ban đầu của phần Kinh Thánh tiếng Hy Lạp, thường gọi là Tân ước. Dần dần, ông tin chắc rằng sự hiểu biết Kinh Thánh là điều thiết yếu. Vì thế, ông khẳng định Kinh Thánh phải được dịch sang các ngôn ngữ thông dụng thời đó.

Erasmus ủng hộ sự đổi mới bên trong Giáo hội Công giáo, vì ông tin rằng đạo Đấng Ki-tô phải là một lối sống, chứ không chỉ là giữ các nghi lễ vô nghĩa. Thế nên, khi các nhà cải cách bắt đầu phản đối và đòi có sự thay đổi bên trong Giáo hội La Mã, ông bị Công giáo nghi ngờ.

Trong các tác phẩm của mình, Erasmus châm biếm sự sai trái và lối sống phô trương của giới tu sĩ, cũng như tham vọng của những giáo hoàng khi ủng hộ các cuộc chiến. Ông khác biệt với các tu sĩ, là những người lợi dụng nghi thức của giáo hội, như xưng tội, thờ các thánh, kiêng ăn và hành hương, để trục lợi từ giáo dân. Ông cũng bất bình với các thực hành của giáo hội như việc bán phép giải tội và luật độc thân.

Năm 1516, Erasmus xuất bản phần Tân ước tiếng Hy Lạp đầu tiên của ông. Đây cũng là lần đầu tiên phần Kinh Thánh tiếng Hy Lạp được ra mắt bằng bản in. Công trình của Erasmus gồm phần chú giải cũng như bản dịch phần Kinh Thánh tiếng Hy Lạp sang tiếng La-tinh, và bản này khác với bản Vulgate. Qua thời gian, ông tiếp tục hiệu đính bản dịch của mình, và tác phẩm cuối cùng lại càng khác bản Vulgate tiếng La-tinh hơn nữa.

Một trong những khác biệt nằm ở câu 1 Giăng 5:7. Để ủng hộ giáo lý không có trong Kinh Thánh là thuyết Chúa Ba Ngôi, người ta đã thêm vào bản Vulgate một số từ ngụy tạo gọi là comma Johanneum. Câu đó như sau: “Trên trời, Chúa Cha, Ngôi Lời và Chúa Thánh Ma: và cả ba là một”. Tuy nhiên, Erasmus đã loại những từ ấy khỏi hai ấn bản Tân ước đầu tiên của ông, vì không bản chép tay tiếng Hy Lạp nào mà ông tham khảo có những từ ấy. Sau đó, giáo hội gây áp lực bắt ông thêm chúng vào ấn bản thứ ba của ông.

Các ấn bản Tân ước được cải thiện của Erasmus đã trở thành nền tảng cho các bản dịch tốt hơn sang ngôn ngữ châu Âu. Martin Luther, William Tyndale, Antonio Brucioli và Francisco de Enzinas đã dựa trên chúng để dịch phần Kinh Thánh tiếng Hy Lạp sang tiếng Đức, Anh, Ý và Tây Ban Nha.

Erasmus sống trong giai đoạn tôn giáo nhiễu nhương, và bản Tân ước tiếng Hy Lạp của ông được xem là sự trợ giúp quý giá cho các nhà cải cách Tin Lành. Một số người cũng xem Erasmus là một nhà cải cách, cho đến khi Phong trào Cải cách chính thức bùng nổ. Ông không đứng về phe nào trong các cuộc tranh luận lớn về thần học diễn ra sau đó. Điều thú vị là cách đây hơn 100 năm, học giả David Schaff viết rằng Erasmus “đã qua đời trong cô độc, không theo phe nào. Ông không được Công giáo công nhận, và ông cũng chẳng theo Tin Lành”.